其实我个人一直觉得保护碱基只要按模板延长几个就行了。 并不是一定需要特定的碱基。 应该避免的只有重复碱基或导致引物二聚体的碱基。 我们以前看到过一些东西，是根据现有的模板直接设计的。 我没有选择过特定的碱基。 该酶要求不高，如下所示，保护碱2-5个，酶切活性可以保证50-100%，设计5-6个基本上是万无一失的。 注册片段
没有什么特别的。 酶切位点前或后添加2-3bp碱基即可。 但是，请注意保持引物设计的原则和不制作新的酶切部位
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